Au XIVe siècle, la ville n'est pas épargnée par les famines, la peste noire et la guerre en Europe. Comme tout le Rouergue, elle passe sous domination anglaise en 1360 (traité de Brétigny), entre dans la principauté d'Aquitaine, avant de réintégrer le domaine royal en 1370. Elle redevient ville-marché puisqu'à la fin de l'époque médiévale (1437), ses foires annuelles (du Carême, du 6 mai) sont fréquentées par les marchands du Languedoc, du Roussillon, de l'Espagne. La cité produit des draps depuis le XVe siècle.
A partir de 1562, Millau s'impose comme une place forte du calvinisme méridional. Les idées de la Réforme et les prêches des missionnaires cévenols ont commencé, dès 1558, à séduire les notables de la ville. Dès le début de la première guerre de Religion, les fortifications médiévales sont reconstruites, transformant Millau en citadelle. La gestion de la ville semble alors toute consacrée aux affaires militaires.
« L'Edit de pacification de 1576 ne peut rien changer au caractère tout protestant de Millau, ville forte, écrit l'historien Emmanuel Le Roy Ladurie. Dès 1573, un collège de tendance huguenote y était fondé ». La même année, les Etats généraux protestants se tiennent à Millau, rassemblant des villes et bourgs languedociens, cévenols, ainsi que quelques députés du pays d'Oïl. Pendant les guerres de Rohan (1620-1629), du nom du duc commandant le parti protestant en Languedoc, Millau est un point d'appui stratégique du soulèvement huguenot dans le Sud.
Après l'édit d'Alès en 1629, les huguenots doivent se replier, des familles de notables millavois sont contraintes à l'exil. Face aux dragonnades en Rouergue, les protestants de Millau abjurent collectivement en 1685 dans l'église Notre-Dame.
Les guerres de religion ont été pour la ville « un temps fort calamiteux et misérable », écrit le « calviniste de Millau » dans ses Mémoires.
